Cuarta sesión, 25 de marzo

 Lo primero que hicimos fue comprobar el crecimiento del micelio inoculado en las bolsas la sesión anterior. Excepto en unas pocas bolsas, en la mayoría no se observaba en micelio.

En esta sesión ha estado principalmente dedicada a la inoculación de trufa negra. Hemos llevado a cabo los primeros pasos de la preparación de la trufa para posteriormente ser inoculada en una encina y conseguir micorrizas.

PROCESO DE INOCULACIÓN DE TRUFA NEGRA

1- Las trufas deben almacenarse hasta que estén lo más maduras posibles, ya que de esta manera las esporas estarán en mejores condiciones para poder llevar a cabo el proceso. Al mantener las trufas un tiempo madurando dejan de ser comestibles.

2- Cuando las trufas están en las condiciones adecuadas se extraen de las bolsas donde se almacenan y se vierten en una bandeja. A continuación deben lavarse cuidadosamente una a una con un cepillo para retirar la tierra y suciedad que contengan. Tuvimos suerte ya que las trufas que lavamos no estaban excesivamente sucias.

3- A continuación se debe rociar las trufas con alcohol por toda su superfice para eliminar todos los microorganismos presentes en ellas. Luego se las seca y se echan en una bandeja.

Durante estos tres procesos es muy importante fijarse en que todas las trufas sean trufas negras. Si se detecta alguna anomalía en alguna trufa debe retirase del resto para ser analizada al microscopio. Durante el proceso encontramos varias trufas que podían no ser trufas negras. Realizamos las preparaciones para el microscopio como aprendimos en la primera sesión para cada una de las trufas. Esto no permitiría ver las esporas y poder identificar que tipo de trufa era. En las primeras muestras observamos claramente las esporas características de las trufas negras, pero, por desgracia para el viverista que había mandado las trufas a continuación identificamos otros tipos de trufa. Algunas de ellas eran trufas de verano (tuber aestivum) cuyas esporas son más claras y redondeadas que las de la trufa negra.
 Es muy importante retirar las trufas de otros tipos ya que a con una sola que no se trufa negra se puede contaminar todo el lote de plantas micorrizadas.

Esta sesión hemos realizado solamente estos últimos pasos. Estos son los que deberían hacerse a continuación:

4- Las trufas se trituran con la batidora y se les añade agua para formar un caldo esporal. Este caldo esporal se inocula a las encinas. Estas encinas han sido plantadas en enero para que cuando se realice la inoculación, en abril, ya cuenten con raíces secundarias, las únicas aptas para la micorrización.

5- Hacia el mes de noviembre se compruba si la micorrización ha sido exitosa. Este paso si que le hemos realizado en esta sesión. Se cogen las plantas y se limpian las raíces retirando toda la tierra posible. A continuación se observan las raices a con la lupa. Se cuentan 250 ápices de cada planta fijándose en cuantos están micorrizados. La micorriza se observa por un engrosamiento en el extremo de la raíz. Nosotros no llegamos a contar los 250 ápices, simplemente nos dedicamos a observar algunas micorrizas. Para que una planta se considere exitosa debe tener al menos una 30% de los ápices micorrizados.

Tercera sesión, 18 de marzo

Esta sesión ha sido la más practica hasta el momento. Hemos aprendido cada paso para inocular una bolsa de astillas con saprófitos y una de turba vermiculita con MMN con micorrícicos.

PASOS PARA LA INOCULACIÓN: 

Turba vermiculita

Astillas de chopo

1- Elaboración del sustrato (turba vermiculita):
Cada bolsa de sustrato contiene 2L en volumen, y contiene unas cantidades exactas de vermiculita, turba y medio de cultivo MMN (previamente preparado en el laboratorio como aprendimos en la anterior sesión).



2- Esterilización:
Las bolsas de sustrato se dejan 24h en remojo y después se meten en el autoclave 1h. El autoclave tiene unos programas determinados (temperatura, tiempo...) para elegir el conveniente y eliminar cualquier microorganismo.

3- Inoculación:
Se trabaja en la cámara de flujo laminar con sus respectivas pautas: encenderla antes de empezar a trabajar, limpiar con alcohol, esterilizar los utensilios... y siempre después de haber dejado reposar el sustrato después de su esterilización.
Comenzamos cortando la bolsa del sustrato para poder manejarlo mejor, ya que no se puede tener contacto con la parte de dentro ni los bordes para asegurar que no se infecte. A continuación cogemos las dos placas que vamos a inocular, y con el bisturí esterilizado, las cortamos en cuadraditos para echarlo en el sustrato y que se pueda mezclar bien. Cuando hemos hecho esto, sellamos la bolsa dos veces para asegurarnos de que está bien cerrada, lo agitamos un poco para que se mezcle y se escribe en ella los datos correspondientes.

4- Almacenamiento:
Se guardan las bolsas inoculadas.

TAREA:

También hemos elaborado la repicación de shiitake en cinco placas, y cada uno tenemos una cepa distinta para ver cuál es la que crece mejor. Hemos dibujado unos ejes en la parte de abajo de las placas para medir lo que crecen en cada eje, y nos hemos puesto de acuerdo para medirlo cada tres días (días 21, 24, 27, 30, 2 y 5). Para la última sesión tendremos que observar los resultados que iremos anotando y elaborar gráficas con ellos para poder comparar el crecimiento de cada cepa.

Una placa original y su repicación en cinco placas con los ejes preparados para medir su crecimiento.

Segunda Sesión (Fotos)

En mi opinión la segunda sesión fue mucho más entretenida que la primera, que fue muy teórica a la par que necesaria para llevar a cabo las sesiones prácticas siguientes.
En la segunda sesión realizamos distintas tareas:






 Natalia pesando distintos componentes necesarios para preparar MMN(medios micorrícicos).

Nuestra compañera María preparando un trocito de la seta que va a cortar para aislar.

Aquí Cristina está cortando un trocito de la PDA para introducir en su lugar la porción de la seta que aislamos.

Alfonso empleando un sacabocados para la repicación de Shiitake.

Aquí estoy finalizando la repicación, colocando shiitake en otras placas para obtener más shiitake.

Aquí estamos todos con Olaya que nos ha ayudado a llevar a cabo las distintas tareas de la segunda sesión.

Segunda sesión. Martes 4 de marzo

El martes 4 de marzo hemos tenido nuestra segunda sesión. Ha sido menos teórica que la primera, ya que nos hemos centrado más en crear cultivos, inocular y repicar. La sesión de hoy la hemos realizado únicamente en laboratorio de cultivo.

LABORATORIO DE CULTIVO

 

MEDIOS DE CULTIVO

 

Preparamos MMN (para hongos micorrícicos como el Boletus) en un Erlenmeyer.

 

COMPONENTES (para 1L):

 

-Malta 3g
-Glucosa 10g
-Sulfato de magnesio MgSO4   0.15g
-Fosfato de amonio (NH4)2HPO2  0.5g.
-Dihidrógenofosfato de potasio KH2PO4   0.5g
-Cloruro cálcico CaCl2  0.05g
-Agar 15g
-Cloruro sódico NaCl  0.02g
-Cloruro férrico FeCl3  1.2ml à (como está en estado líquido, para cogerlo utilizamos una pipeta)
-Tiamina 1ml à (como está en estado líquido, para cogerlo utilizamos una pipeta)
-Agua 1L à (se utiliza un matraz aforado para coger la cantidad exacta)

 

Cuando están todos los componentes en el Erlenmeyer, se echa un imán en la mezcla y se coloca en el agitador para que se junte todo, al removerse.

Cuando la mezcla está removida, se mide su pH. El pH del MMN tiene que ser 5.5. Para medirlo, metemos el pH-metro y vamos añadiendo poco a poco gotas de ácido clorhídrico con ayuda de una pipeta, hasta que llegue a 5.5. El pH-metro debe calibrarse cada 7 días. Para calibrarlo, usamos unos tampones con un pH determinado.

 

 

A continuación se mete la mezcla en el autoclave, que funciona como una olla a presión, y aquí se calienta. (Nosotros no hemos hecho este paso por su larga duración)

 La mezcla es líquida, pero después, debido al agar se solidifica y entonces ya está listo.

  

AISLAMIENTO

Utilizamos el medio de cultivo PDA para aislar Shiitake

 

Primero se coge la placa de petri, que posee una base gelatinosa de agar y se corta un trocito de la basecon forma de triángulo.

Se coge la seta, se corta un triangulo poco profundo con el bisturí y se introduce en la placa de petri, en el espacio donde hemos cortado el triángulo de agar.

Después, la placa se rodea con film para aislarla y que no entre nada.

Por último cada placa se identifica. Se escribe IDF (IDForest) + la fecha al revés + el número de cepa + la fecha.  Ejemplo: IDF140304151 04-03-14

 

 En el centro de la foto podemos observar el resultado final que debería salir a partir de las placas del borde, que son las que hemos hecho nosotros

REPICACIÓN

 

Cuando el micelio crece, se repica con un sacabocados para colocarlo en otras placas y que siga creciendo. La repicación consiste en separar pequeños trozos del micelio con ayuda de este instrumento circular (sacabocados), transportarlos con ayuda de un bisturí, y colocarlos en  nuevas placas de petri con agar. Estos trozos se separan siempre de la periferia del micelio, ya que es el más reciente y se dan la vuelta para colocarlos encima del agar. Este proceso se repite tres veces para obtener tres trocitos en cada placa de petri, y después se sella con film. Por último se identifica exactamente igual que la placa de la que procede, pero se cambia la fecha y se almacena a una temperatura de 20ºC

 

 

 

TAREA

 

La tarea de esta sesión es buscar el significado de cepa:

 



Cepa: Grupo de organismos dentro de una especie o variedad.

En una planta, parte enterrada del tronco que está unida a las raíces.

 

Cepa Bacteriana: Colonia microbiana procedente de un solo germen obtenido de un enfermo, y multiplicado por pases sucesivos en diferentes medios de cultivo.